Dentro del género Acanthamoeba existen especies relacionadas con patologías presentes en los humanos. Su identificación y clasificación se realizaba por morfología, pero es subjetiva y de baja sensibilidad y especificidad. Por ésto, es importante incorporar herramientas de biología molecular. El objetivo de esta investigación fue caracterizar molecular y morfológicamente 24 aislados de Acanthamoeba, mantenidos en el Laboratorio de Amibiasis-Escuela de Bioanálisis-UCV, mediante PCR-RFLP (HinffI, HhaI y HaeIII), previamente identificados morfológicamente como Acanthamoeba (Pussard y Pons 1977). Ningún aislado perteneció al grupo I. De los 24 aislados, 45,8% presentó características morfológicas compatibles con el grupo II, 45,8% con el grupo III y 8,4% con ambos grupos. Molecularmente, 50% de los aislados amplificaron productos de 900 pb y 50% de 700 pb. Los aislados del grupo III, no se pudieron caracterizar molecularmente por PCR-RFLP, ya que el patrón de digestión no coincidió con patrones previamente publicados. Solo se identificó el 33% de los aislados resultando: A. polyphaga (A9, A12, A13, A14), A. castellanii (A26, A27, A28 y A29) y A. castellanii o A. polyphaga (A15, A25 y A30). Las especies identificadas coinciden con las patógenas más comúnmente descritas en la literatura.